. На второй день простой анализ основных эффектов показал, что в жировых трубках снова наблюдается значительно более высокая скорость осаждения макроорганических веществ, чем в тонких трубках, когда они расположены в Смешанный F-массив ( p = 0,0004). Напротив, значительная корреляция соотношения сторон и улова также может быть идентифицирована для несмешанных массивов ( p = 0,0179) на 2-й день. Однако, как и в день 1, в Mixed-T ( p = 0.9390), различий между соотношением сторон и уловом не было. Таким образом, жировые трубки демонстрируют более высокие скорости осаждения макроорганических веществ, чем тонкие трубки в несмешанных массивах, например 0,6 мг · см ⁻² против 0,4 мг · см ⁻² на 2-й день (рис. 3f).

Массивы с жировыми трубками улавливают большее количество макроорганических веществ (рис. 4a, c). Наибольшее количество макроорганических веществ было захвачено в массиве Mixed-F, за которым следовали Unmixed-F в оба дня. В Mixed-F 0,238 мг · см ^-2 органического материала откладывались на 1-й и 0-й день.014 мг · см ⁻² на 2 день. В несмешанном-F скорость отложения макроорганических веществ в жировых трубках составляла 0,173 мг · см ⁻² в день 1 и 0,012 мг · см ⁻² в день. 2. Несмешанный-Т и смешанный-Т, следовательно, оказались менее эффективными при улавливании органических веществ. Действительно, в несмешанном-T скорость осаждения макроорганических веществ в тонких трубках составляла 0,146 мг · см ^-2 в день 1 и 0,007 мг · см ^-2 в день 2. В Mixed-T 0,089 мг · см ^-2 органического материала выпало на 1-й и 0-й день.009 мг · см ^-2 на 2-й день. Эти наблюдения считаются статистически разными, потому что количества макроорганических веществ, уловленных в пробирках, значительно различались между двумя днями ( p = 0,0000). Смешанные массивы значительно повлияли на распределение макроорганических веществ между жиром и тонкими трубками в оба дня ( p = 0,0001 в день 1 и p = 0,0000 в день 2, рис. 4a, c). В Mixed-F распределение было следующим: 28,72% в тонких трубках и 71.28% в жировых трубках в первый день, но 6,92% в тонких трубках и 93,08% в жировых трубках на второй день. В Mixed-T распределение было следующим: 55,77% в тонких трубках и 44,23% в жировых трубках в первый день и аналогично 53,53% в тонких трубках и 46,47% в жировых трубках на 2-й день. Следовательно, в Mixed-T жировые трубки захватили относительно больше макроорганических веществ на своей поверхности, чем тонкие трубки.

Суммарная скорость осаждения макроорганического материала и отложений, захваченных на каждый массив. Графики ( a ) и ( c ) показывают скорость осаждения макроорганических веществ, уловленных каждой группой в день 1 и день 2, соответственно.Графики ( b ) и ( d ) показывают скорость осаждения отложений на массив в день 1 и день 2, соответственно. Различные массивы отсортированы по горизонтальной оси в соответствии с площадью, занимаемой отверстиями для тонких трубок. Обратите внимание на изменение масштаба между левой и правой колонками.

Улавливание отложений в трубках и свойства отложений

Помимо макрофауны и крупного органического материала, в трубках также улавливается осадок. В целом, сухой вес осадка, уловленного в трубках, был больше в 1-й день, чем во 2-й день, при этом количество уловленного осадка в 1-й день в среднем в 3 раза больше, чем во 2-й день как для тонких, так и для толстых трубок ( p = 0.0000 из т -тест, рис. 3в, ж). В пределах каждого массива разница в улавливании осадка между двумя соотношениями сторон трубок была значительной в оба дня (таблица 2). В несмешанных массивах жировые трубки захватывают большее количество осадка, чем тонкие трубки: 280,2 мг против 156,6 мг ( p = 0,0005) в день 1 и 55,0 мг против 41,0 мг во 2 день ( p = 0,0237, рис. 3c, грамм).

Двусторонний дисперсионный анализ ANOVA также был проведен на образце из 175 и 167 пробирок для изучения влияния соотношения сторон и матрицы на улавливание осадка в день 1 и день 2, соответственно (таблица 3).Наблюдалась значительная взаимосвязь между эффектами соотношения сторон и массива на улавливание отложений, F (2170) = 5,61, p = 0,0044 в день 1 и F (2162) = 5,59, p = 0,0045 во 2 день. В день 1 простой анализ основных эффектов показал, что тонкие трубки имели значительно более высокие скорости осаждения осадка, чем толстые трубки, когда они располагались в массиве Mixed-T ( p = 0,0472) и в несмешанных массивах ( p = 0,0000), но не было различия между форматом изображения при размещении в Mixed-F ( p = 0.0816). На 2-й день простой анализ основных эффектов показал, что тонкие пробирки имели значительно более высокие скорости осаждения осадка, чем жирные пробирки, когда они располагались в несмешанных массивах ( p = 0,0000), но не было различий между соотношением сторон при помещении в Mixed-F ( p = 0,8138) или и в Mixed-T ( p = 0,6483). Действительно, в несмешанных массивах жировые трубки показали меньшую скорость осаждения осадка, чем тонкие трубки: 39,6 мг · см ⁻² по сравнению с 69,0 мг · см ⁻² в день 1 и 7.8 мг · см ⁻² по сравнению с 18,1 мг · см ⁻² на 2-й день (рис. 3d, h).

В целом, большее улавливание осадка положительно коррелировало с большим количеством тонких трубок и, следовательно, меньшим количеством жировых трубок. В оба дня наибольшее количество осадка выпало на Несмешанный-Т (рис. 4b, d). Действительно, в несмешанных массивах скорость осаждения осадка в несмешанном-T составляла 1,39 мг · см ^-2 в день 1 и 0,58 мг · см ^-2 в день 2, тогда как в несмешанном-F она составляла 0,64 мг. · См ⁻² в сутки 1 и 0.14 мг · см ^-2 на 2 день. В Mixed-F 0,90 мг · см ^-2 осадка выпало на 1 день и 0,25 мг · см ^-2 на 2 день. , 0,58 мг · см ^-2 осадка выпало на 1-й день и 0,32 мг · см ^-2 на 2-й день. Эти наблюдения считаются статистически разными, поскольку количества осадка, захваченного в трубках, значительно различались между 2 дня ( р = 0,0000).

В смешанных массивах количество захваченного осадка распределялось между жирной и тонкой трубками.Эти массивы значительно повлияли на распределение осадка между толстыми и тонкими трубками в оба дня ( p = 0,0000 в оба дня). В Mixed-F, где 30% поверхности, занимаемой отверстиями трубок, соответствуют тонким трубкам, а 70% — жировым трубкам, распределение было следующим: 26,05% в тонких трубках и 73,95% в жировых трубках в первый день и 25,97%. в тонких трубках и 74,03% в жировых трубках на 2-й день. В Mixed-T, где 70% поверхности, занимаемой отверстиями трубок, соответствуют тонким трубкам, а 30% — жировым трубкам, распределение было следующим: 79.51% в тонких трубках и 20,49% в жировых трубках в первый день и 75,55% в тонких трубках и 24,45% в жировых трубках на второй день.

Свойства осадка, захваченного в трубках, были проанализированы для изучения любой зависимости от соотношения сторон (Таблица 4). Во-первых, содержание органического вещества было немного больше в день 1, чем в день 2: 7,19% против 5,61%, когда учитываются результаты по всем пробиркам. В день 1 тонкие трубочки содержали меньше органического вещества, чем жировые трубки в Mixed-T и несмешанных массивах, например в последнем случае 5.92% (тонкие трубки) против 8,13% (жировые трубки; p = 0,0022; Таблица 2). Противоположная тенденция наблюдалась для Mixed-F: 7,32% в тонких трубках и 5,97% в жировых трубках ( p = 0,0293; Таблица 2). На 2-й день наблюдалась значительная разница в содержании органического вещества только для несмешанных массивов: 4,44% в тонких трубках против 7,97% в жировых трубках ( p = 0,0000; Таблица 2).

Во-вторых, средний диаметр зерна был меньше в день 1, чем во второй день (Таблица 4). В то время как в первый день имелась значительная разница в размере зерен между решетками, а также в соотношении сторон трубок, размер захваченных зерен был ближе к однородному на второй день. Действительно, в первый день тонкие трубки захватывали более мелкие частицы, чем жировые трубки в несмешанном массивы ( p = 0,0007; Таблица 2). Для сравнения, средний диаметр зерен окружающего поверхностного осадка составлял 189.50 мкм в 1-й день и 193,00 мкм во 2-й день.

В соответствии с результатами по размеру зерен содержание иловой глины в захваченном осадке было намного больше в день 1, чем в день 2: от 15,10% до 24,08% в день 1 и от 5,54% до 9,43% на второй день (таблица 4). В день 1 только несмешанные матрицы показывают четкую разницу: 15,10% для тонких трубок против 24,08% для жирных трубок ( p = 0,0016; Таблица 2). На 2-й день четкой тенденции не наблюдалось. Для сравнения, содержание алеврита и глины в окружающих поверхностных осадках составляло 11.47% в день 1, что меньше, чем осадок, уловленный в пробирках. На 2-й день уловленный осадок показал содержание мелких частиц, аналогичное окружающему поверхностному осадку (7,78%).

Количество трубок оказалось отрицательно коррелированным с процентным содержанием мелких частиц и TOM (общее количество органических веществ; Рис. 5). Линейные регрессии предполагают уменьшение количества мелких частиц и TOM при увеличении количества трубок с коэффициентами детерминации до 0,88 для TOM на 2-й день независимо от соотношения сторон (рис.5).

Изменение свойств осадка в зависимости от количества пробирок. a и c соответствуют соотношению между содержанием ила-глины (%) осадка, захваченного в трубках (жирных и тонких трубках вместе), и количеством трубок на м ² в день 1 и день 2 соответственно. b и d соответствуют соотношению между содержанием органического вещества (%) осадка, задержанного в трубках (жирные и тонкие трубки вместе), и количеством трубок на м ² в день 1 и день 2 , соответственно.На всех графиках пунктирная линия показывает результаты линейной регрессии.

Фоновое отложение отложений

Для оценки отложения наносов в каждом массиве две плитки были вставлены в слой отложений в случайных местах. Количество осадка, нанесенного на плитки в контрольном массиве, было в два раза больше в день 1, чем в день 2 (рис. 6). Наличие трубок, по-видимому, уменьшило отложение осадка в несколько более суровых условиях первого дня. Действительно, в первый день осаждение осадка было примерно в два раза больше в контрольной группе, чем в массивах, содержащих трубки (рис.6): 12,8 мг · см ^-2 по сравнению с 6,8 мг · см ^-2 . На 2-й день отложения осадка в контрольном массиве и в массивах с пробирками, кроме Mixed-F, были одинаковыми, то есть 7,5 мг · см ^-2 и 5,7 мг · см ^-2 , соответственно (рис. 6).

Отложение осадка в мг · см ⁻² оценено для каждого массива плиток. Различные массивы отсортированы по горизонтальной оси с увеличением количества тонких трубок вправо. Вертикальные линии, нанесенные наверху столбцов, соответствуют стандартным ошибкам

Численное моделирование

Результаты двухмерного моделирования гидродинамики имитированных нор крабов показаны на рис.7. Когда поток встречает отверстия труб, турбулентная кинетическая энергия усиливается внутри труб и вдоль донного слоя на нижней по потоку стороне норы (рис. 7). Для обоих соотношений сторон внутри трубок развиваются уложенные друг на друга вихри: три отдельные вихревые ячейки образуются в жировых трубках, тогда как четыре вихря образуются в тонких трубках (рис. 7a, b). Глубина проникновения потока в «крабовые норы» зависит от соотношения сторон, при этом вихри уходят дальше вниз в жировые трубки. Однако только самая верхняя ячейка вихря показывает существенно улучшенные значения TKE.Более того, этот главный вихрь в жире более турбулентный, чем в тонких трубках. Вне трубок турбулентность, создаваемая взаимодействием потока с отверстиями трубок, кажется более интенсивной, но более короткой продолжительностью (более быстро рассеиваемой) для жира, чем для тонких трубок, на что указывают более высокие значения TKE ниже по потоку (рис.7). .

Результаты 2D моделирования с OpenFOAM. a Скриншот картины потока в жировой трубке (соотношение сторон 3,8), построенный с помощью Paraview. b Снимок экрана схемы потока в тонкой трубке (соотношение сторон 7,1), построенный с помощью Paraview. c Профили скорости вниз по потоку (по оси X), извлеченные по оси Z в центре трубок, то есть X = 0 см. d Профили вертикальной скорости (по оси Z), извлеченные по оси X в центре отверстий трубки и Z = — 1 см. d соответствует диаметру трубы, а AR обозначает аспектное отношение

Профили вертикальной скорости логарифмические над слоем, имитирующие применяемые условия притока (рис.7в). Средние горизонтальные скорости ( _X ) внутри трубок демонстрируют отклонения этого профиля до Z = 3,3 см и Z = 1,9 см для толстых и тонких трубок, соответственно (рис. 7c, d). Кроме того, профили средней горизонтальной скорости (Ū _Z ) асимметричны вокруг центральной линии трубы на 1 см ниже отверстий в обеих трубках (рис. 7d). Нисходящие скорости до 7,8 мм · с ^-1 могут наблюдаться на выходе из жировой трубки, тогда как восходящие скорости равны 4.9 мм · с ⁻¹ на стороне входа. Аналогичным образом, нисходящие скорости на стороне выхода тонкой трубки достигают значений 2,1 мм · с ^-1 , а восходящие скорости до 1,6 мм · с ^-1 на стороне входа тонкой трубки.

Метаболомический анализ морских и грязевых крабов на основе антибактериальной активности

Основные моменты

•

Экстракты берут из морских и пресноводных целых крабов для изучения и анализа функций их метаболитов.

•

Было обнаружено, что метаболиты крабов обладают антибактериальными, противогрибковыми, противовирусными и противовоспалительными свойствами, которые могут быть использованы в фармацевтической промышленности.

•

Противомикробные соединения, содержащиеся в гемолимфе крабов и крабах, содержащихся во всем теле, предоставляют возможность для производства альтернативы антибиотикам.

•

В этом исследовании предлагается использовать цельные экстракты крабов в диетах для повышения устойчивости.

Abstract

Все чаще становится известно, что изолированные соединения морских беспозвоночных обладают различной фармакологической активностью, благодаря чему были разработаны многие полезные лекарства. Крабы содержат биологически активные соединения, включая антибактериальные, противогрибковые и противовирусные метаболиты, выделенные из различных тканей и органов, которые произвели революцию в лечении серьезных заболеваний. Настоящее исследование представляет собой первую попытку изучить и сравнить природные антибактериальные свойства цельного экстракта морского синего краба-пловца Portunus pelagicus и грязевого краба Scylla tranquebarica против патогенных бактерий рыб.Жидкостная хроматография / масс-спектрометрия с использованием метода метаболомики на основе времяпролетного (TOF) масс-анализатора (LC / MS-QTOF) была использована для характеристики вариации продукции вторичных метаболитов у краба P. pelagicus и S. tranquebarica . местообитания в Малайзии. Различные метаболиты оцениваются у обоих видов крабов с помощью LC / MS-QTOF. Первоначально было идентифицировано всего 75 метаболитов, и только 19 метаболитов соответствовали пороговому значению P-Corr менее 0,01 и по меньшей мере 2-кратному изменению.Эти метаболиты, обладающие противовоспалительными и антибактериальными свойствами, подавлялись в образцах S. tranquebarica и повышались в образцах P. pelagicus . Биологический анализ in vitro метанольных экстрактов P. pelagicus показал лучший антимикробный ответ против грамположительных бактерий, Streptococcus agalactiae и грамотрицательных бактерий, Vibrio alginolyticus, Klebsiella pneumoniae, и Escherichia statically значимая разница ( P < 0.05) экстрактов P. pelagicus по сравнению с S. tranquebarica . Результаты показывают, что оба типа экстрактов крабов являются бактерицидными при более высоких концентрациях и бактериостатическими при более низких концентрациях. В этой рукописи рассказывается о роли морских и грязевых крабов с особым упором на их вторичные метаболиты, а также обсуждаются текущие и будущие разработки как в производстве желаемых метаболитов крабов, так и в их потенциальном использовании в фармацевтической промышленности.

Ключевые слова

Метаболомика

Крабы

Нецелевое профилирование

Антибактериальная активность

ЖХ – МС / Q-TOF

Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

© 2017 Авторы.Опубликовано Elsevier B.V.

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

Frontiers | Взаимосвязь между профилями жирных кислот и кишечными бактериальными сообществами китайского митенового краба (Eriocheir sinensis) из экологически разных мест обитания

Введение

Китайский краб-рукавица ( Eriocheir sinensis ) — одно из самых экономически важных и питательных ракообразных в Китае (Chen et al., 2007). Это пресноводный норный краб среднего размера, обитающий в реках и эстуариях восточного побережья, который питается Желтым морем и охватывает Китай и Корею (Zhang et al., 2001; Рудник и др., 2003). Он проводит большую часть своей жизни в пресной воде, а затем мигрирует в море или океан для размножения (катадромный вид) (Zhang et al., 2001; Rudnick et al., 2003; Cheng et al., 2008; Sui et al. , 2009). Производство и стоимость китайского митенового краба значительно выросли в период с 1990 по 2012 год, что отражает растущее значение этого вида для сектора аквакультуры Китая (Chen et al., 2007; Chen et al., 2015; Wang et al., 2015, 2016). . В 2015 году было выловлено около 820 000 тонн этих крабов, что составило более 50 миллиардов йен (Министерство сельского хозяйства Китайской Народной Республики, 2016; Dong et al., 2018). Однако есть некоторые проблемы и ограничения, связанные с его культурой (например, потенциальная вспышка болезни), сохранением и управлением; и необходимость повышения его питательной ценности (Ding et al., 2016; Shen et al., 2017). Следовательно, больше внимания было уделено пониманию его здоровья, питания и сохранения.

Недавний исследовательский подход к улучшению здоровья, питания и экономических ценностей, а также к сохранению водных видов заключается в понимании роли кишечных микробных сообществ (Roeselers et al., 2011; Egerton et al., 2018; Цзэн и др., 2018; Trevelline et al., 2019). Недавние исследования показали, что микробные сообщества играют важную роль в пищеварении животных, иммунном ответе, физиологии и реакции на лечение заболевания (Heijtz et al., 2011; Stanley et al., 2014; Waite and Taylor, 2015; Zheng et al. , 2017; Ramos, Hemann, 2017; Byndloss et al., 2017). В соответствии с этой точкой зрения, были проведены некоторые исследования для понимания принципов, регулирующих сборку и поддержание микробного сообщества в кишечнике китайского миттенового краба, путем разработки надежных модельных систем для изучения взаимодействий между хозяином и микробом (Chen et al., 2015; Zhang et al., 2016; Донг и др., 2018). В недавнем исследовании были изучены бактериальные сообщества, обнаруженные в кишечнике крабов, выращиваемых в озере Тай, Китай (Chen et al., 2015). В другом исследовании Zhang et al. (2016) оценили различия между микробиотой кишечника и окружающей средой. Кроме того, Донг и др. (2018) провели сравнительный анализ экспрессии генов кишечного бактериального сообщества и экспрессии генов кишечного иммунитета у этих крабов. Однако все еще существуют огромные пробелы в знаниях о взаимодействии между кишечным микробным сообществом и биохимическим составом этих крабов.

В целом, связи между кишечными микробными сообществами и приблизительным составом китайского митенового краба не установлено. Однако предыдущие исследования, оценивающие взаимосвязь между непосредственным составом животных и географическим положением или микробными сообществами животных и их местонахождением, предполагают возможные связи между кишечным микробным сообществом и ближайшим составом (Zenebe et al., 1998; Riveiro et al., 2011 ). Сообщается, что ближайший состав одних и тех же видов, живущих в разных средах, значительно отличается (Zenebe et al., 1998; Ривейро и др., 2011; Roeselers et al., 2011; Мохан, 2013, стр. 960–963; Антоний, 2016). Аналогичным образом, количество и состав кишечной микробиоты видов-хозяев значительно различаются в зависимости от их географического положения (Finkel et al., 2011; Franchini et al., 2014). Кроме того, некоторые исследования показали прямую связь между микробиотой кишечника и его непосредственным составом. Например, у перепелов и людей модуляция кишечной микробиоты вызывала изменения в профилях жирных кислот (ЖК).У японских перепелов-несушек ( Coturnix coturnix japonica ) состав ЖК липидов печени может быть изменен путем изменения микробиоты кишечника (Furuse et al., 1992). Кроме того, были идентифицированы бактериальные метаболиты, полученные из полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), которые коррелировали с конкретными фекальными бактериями (виды Bifidobacterium , виды Eubacterium ventriosum и Lactobacillus ) (Druart et al., 2014).

Понимание состава кишечной микробиоты, ее численности и связанных с ней факторов окружающей среды может дать понимание для поддержки эффективного управления, сохранения и улучшения экономических показателей крабовой индустрии.Например, Zhang et al. (2019) определили эффективный механизм, присутствующий в окружающей среде, который можно использовать для улучшения роста вида, что, в свою очередь, может улучшить его экономические показатели. Было обнаружено, что благодаря сочетанию генетики, микробиоты и показателей роста NRT1.1B является связующим звеном между составом корневой микробиоты и использованием азота в рисоводстве (Zhang et al., 2019).

Целью данного исследования было установить взаимосвязь между профилями ЖК и кишечным бактериальным сообществом китайского миттенового краба из экологически разных местообитаний.С этой целью мы проанализировали профили жирных кислот и микробиоту кишечника шести популяций крабов, взятых из шести разных озер в китайской провинции Цзянсу. Профили FA этих популяций крабов были сравнены и сгруппированы, а затем использованы для определения взаимосвязи между географическим положением и профилями FA. Кроме того, мы охарактеризовали микробные сообщества по содержимому кишечника крабов с помощью высокопроизводительного секвенирования генов 16S рРНК. Альфа-разнообразие, кластерный анализ и структуры бактериального сообщества в определенных местах наблюдались для определения их вклада в профили FA.

Материалы и методы

Сбор проб

В настоящем исследовании шесть популяций китайского краба-рукавицы ( Eriocheir sinensis ) массой 120–150 г были получены из шести разных озер в китайской провинции Цзянсу в декабре 2018 года. Озера — это озеро Чандан (C), озеро Гученг. (G), озеро Гаою (Gy), озеро Хун-цзы (H), озеро Тайху (T) и озеро Янчэн (Y) (Рисунок 1A и Таблица 1). Эти озера являются частью системы водосбора реки Янцзы, они образуют косвенную, но непрерывную водную систему с рекой Янцзы.Популяции китайского краба-рукавицы мигрируют из шести озер в устье реки Янцзы на нерест. Всего было собрано 180 крабов, по 30 в каждом озере (15 самцов и 15 самок), и доставлено в Исследовательский центр пресноводного рыболовства Китайской академии рыбных наук. В каждом озере специально было выбрано пять участков для отбора проб. Биохимические параметры для разных озер не анализировались, тем не менее, стандартные параметры воды для озер, где отбирались популяции крабов, можно найти в (GB3838-2002).По прибытии из всех популяций случайным образом было отобрано 48 крабов (восемь крабов из каждого озера, четыре самца и четыре самки).

Рис. 1. Участки сбора образцов, кластер дендрограмм и PCA. (A) Пункты сбора проб. (B) Кластерный анализ дендрограммы популяций крабов на основе их профилей жирных кислот. (C) PCA-анализ популяций крабов на основе их профилей жирных кислот.

Таблица 1. Информация о месте отбора проб.

Подготовка проб

Микробный образец кишечника

Поверхности тел случайно выбранных крабов (48) промывали стерильной водой и дезинфицировали 75% этанолом в течение 2 мин. Впоследствии они были рассечены для удаления пищеварительного тракта и сбора содержимого кишечника (дистальный отдел). Содержимое кишечника собирали в стерильные пробирки и хранили в морозильной камере при -80 ° C, а затем использовали для экстракции бактериальной ДНК. Остальные части тела краба, оставшиеся после сбора содержимого кишечника, также хранили при -80 ° C.

FA Образец

48 крабов были собраны из морозильной камеры через 2 дня со дня прибытия и оставлены оттаивать, а затем 6-8 г мышц были удалены из панциря придатков каждого краба. Эти мышечные ткани сушили с использованием вакуумной сублимационной сушилки (Labconco Corp., Канзас-Сити, Миссури, США) и измельчали ​​до порошкообразной формы с помощью ступки и пестика. Высушенные образцы хранили в пластиковых пакетах с застежкой-молнией и хранилище при -20. После этого их отправили в лабораторию для анализа профиля FA.

Экстракция и анализ жирных кислот

Примерно 2–3 г наземных мышечных тканей каждого краба добавляли в пробирки, добавляли смешанный раствор (хлороформ / метанол, 2: 1 об. / Об.) И проводили колебательную экстракцию. Колебательную экстракцию проводили трижды, затем фильтровали и выпаривали фильтраты. После этого добавляли 2 мл 0,5 моль / л гидроксида натрия в метаноле и раствор помещали на водяную баню при 60 ° C на 30 мин. Раствору давали остыть, затем добавляли 2 мл 25% трифторида бора в метаноле и снова помещали на водяную баню при 60 ° C на 20 мин.После охлаждения добавляли 2 мл н-гексана и 2 мл насыщенного раствора хлорида натрия для получения метиловых эфиров жирных кислот. Полученные метиловые эфиры жирных кислот анализировали с помощью газовой хроматографии (хроматографическая колонка: DB-WAX 30 M I.D. 0,32 мм; Shimadzu GC-2030, Европа). Первоначально температуру колонки поддерживали на уровне 100 ° C в течение 3 минут; затем увеличивали до 180 ° C со скоростью 10 ° C / мин и выдерживали в течение 1 мин; и, наконец, увеличили до 240 ° C со скоростью 3 ° C / мин и выдерживали в течение 15 минут. Весь процесс анализа занял 95 мин.Газ-носитель — азот (N ₂ ) со скоростью потока 3 мл / мин, топливный газ — водород (H ₂ ) со скоростью потока 40 мл / мин и газ-окислитель — воздух со скоростью потока 400 мл. / мин. Порт инжекции и датчик температуры поддерживали при 250 ° C. Идентификация FA была основана на известном стандартном времени удерживания (Sigma-Aldrich Co., Сент-Луис, Миссури, США). Состав ЖК представлен как процентное содержание каждой ЖК по сравнению с общим содержанием жирных кислот.

Экстракция ДНК

Перед экстракцией ДНК содержимое кишечника и слизистую оболочку каждого отдельного краба собирали и полностью перемешивали с использованием ручного гомогенизатора тканей.Каждый образец содержимого кишечника и слизистой оболочки 48 крабов был разделен на 14 пробирок. Геномную ДНК образца экстрагировали с использованием коммерчески доступного набора (E.Z.N.A® Genomic DNA Isolation Kits, Omega Bio-Tek), следуя протоколам производителя набора. Соответствующее количество (50 мкл) образца ДНК собирали в центрифужную пробирку. Затем чистоту и концентрацию ДНК проверяют электрофорезом (1% гель агрозы, 5 мкл Nared (краситель), 4 мкл образца ДНК, 2 мкл загрузочного буфера и 4 мкл устройства для приготовления DL-1000).Образцы хранили при -20 ° C и позже отправили на дальнейший анализ.

Амплификация, очистка и пиросеквенирование полимеразной цепной реакцией (ПЦР)

На основе геномной области ДНК были выбраны специфические праймеры со штрих-кодами в соответствии с выбором области секвенирования. Праймеры универсальной полимеразной цепной реакции (ПЦР) 515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3) и 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3) (Magoc and Salzberg, 2011; Caporaso et al., 2012), нацеленные на гипервариабельную область V4 16S Ген рРНК (400–450 п.н.) использовали для определения бактериального разнообразия.Реакции ПЦР проводили с использованием смеси Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs, Ипсвич, США) в соответствии с инструкциями производителя. Образцы амплифицировали в трех экземплярах до общего реакционного объема 50 мкл. Каждые 50 мкл реакционной смеси содержали 25 мкл основной смеси Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs, Ипсвич, США), 2,5 мкл каждого прямого и обратного праймера (10 пмоль каждый), 1 мкл ДНК-матрицы (~ 5 нг) , и 19 мкл воды, свободной от нуклеаз. Условия термоциклирования были следующими: начальная денатурация, 98 ° C в течение 30 с, затем 35 циклов по 10 с при 98 ° C (денатурация), 30 с при 65 ° C (отжиг), 30 с при 72 ° C (удлинение ) и окончательное удлинение в течение 10 мин при 72 ° C.Ампликоны оценивали в 2% агарозных гелях. Продукты ПЦР смешивали с равными объемами 1X загрузочного буфера, содержащего SYBR Green, перед загрузкой на гели. Затем продукты ПЦР очищали с помощью набора для экстракции геля Qiagen (Qiagen, Hilden, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Библиотеки секвенирования были созданы с использованием набора TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit (Illumina, Сан-Диего, США) в соответствии с инструкциями производителя, и были добавлены коды индексов.Количественное определение ДНК проводили с использованием флуориметра Qubit® 2.0 с помощью анализа Qubit® dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, США) и системы Agilent Bioanalyzer 2100. Секвенирование проводили на платформе Illumina HiSeq 2500, и были сгенерированы считывания парных концов 250 п.н.

Статистический анализ

Анализ последовательности [включая определение оперативной таксономической единицы (OTU)], таксономическое распределение и оценка состава сообщества в основном проводились с помощью программного обеспечения MOTHOR (Kozich et al., 2013). Считывания парных концов были отнесены к образцам на основе их конкретных штрих-кодов и укорачены путем обрезки штрих-кода и последовательности праймера. Парные чтения были объединены с использованием FLASH (V1.2.7) (Magoc and Salzberg, 2011). Чтобы получить высококачественные чистые теги, необработанные теги подвергались процессам контроля качества с использованием программы QIIME (V1.7.0). Химерные последовательности были идентифицированы и удалены с использованием алгоритма UCHIME (алгоритм UCHIME) для получения эффективных тегов. Последовательности анализировали с помощью программного обеспечения Uparse (Uparse v7.0.1001), а последовательности с сходством ≥ 97% были отнесены к одним и тем же OTU. Для аннотации были проверены репрезентативные последовательности для каждой OTU. Для каждой репрезентативной последовательности для аннотирования таксономической информации использовалась база данных GreenGene, основанная на алгоритме классификатора Ribosomal Database Project (RDP) (версия 2.2). Чтобы исследовать филогенетические отношения OTU и различия между доминирующими видами бактерий в популяции (группах) крабов, было выполнено множественное выравнивание последовательностей с использованием программного обеспечения MUSCLE (версия 3.8.31). Анализ главных координат (PCoA) был проведен для получения главных координат и визуализации сложных многомерных данных. Для отображения анализа PCoA использовались пакеты взвешенного корреляционного сетевого анализа (WGCNA), stat и ggplot2 в программном обеспечении R (версия 2.15.3). Идентифицированные OTU, оценка охвата на основе численности (ACE), Шеннон, Симпсон, охват товаров и Chao1 были рассчитаны с помощью QIIME (версия 1.7.0) и визуализированы с помощью программного обеспечения R (версия 2.15.3). Анализ разреженности был проведен для всех пяти библиотек, а тепловые карты, диаграммы Венна и кривые распределения численности видового ранга были созданы с использованием R Project для статистических вычислений.Расстояния между сообществами кишечных микробов в шести популяциях крабов были рассчитаны с использованием взвешенной метрики бета-разнообразия UniFrac через QIIME. Неметрическое многомерное масштабирование (NMDS) использовалось для визуализации попарных расстояний UniFrac между образцами. Статистический анализ также проводился с использованием критерия Краскела-Уоллиса.

Полученные данные профиля FA для популяций крабов подвергали многомерному дисперсионному анализу с использованием статистического программного обеспечения R (версия 3.1.14) для изучения многомерной структуры и потенциальных различий.Результаты были выражены как среднее значение ± стандартная ошибка, и разница всех средних значений была определена при P <0,05. Кроме того, PCA и другие кластерные (дендрограммные) анализы были выполнены, чтобы понять характер изменения профилей FA среди популяций крабов.

Результаты

Профили FA как биомаркеры популяций крабов из разных географических регионов

Вариация профилей FA в зависимости от географического происхождения популяций крабов

ЖК [насыщенные ЖК (НЖК), мононенасыщенные ЖК (МНЖК), ПНЖК и ненасыщенные ЖК (НЖК)], идентифицированные из шести популяций китайского миттенового краба, и их общие агрегированные проценты показаны в таблице 2.Как правило, численность SFA (C14: 0, C16: 0, C20: 0 и C22: 0) существенно не различалась между популяциями. Однако крабы из H имели значительно более высокие уровни маргариновой кислоты (C17: 0), но более низкие уровни стеариновой кислоты (C18: 0), чем крабы из C, G, Gy, T и Y. Пентадециловая кислота (C15: 0) — еще одна НЖК, которая показала значительные различия ( P <0,05) между популяциями крабов, а самый высокий уровень был обнаружен у крабов из H. Кроме того, уровни пентадециловой кислоты также были выше у крабов из Y, чем у крабов из C.Процент агрегированных SFA был значимым ( P <0,05) и незначимым среди популяций. Хотя он был значительно выше у крабов из Gy, чем у крабов из G, T и Y, не было существенной разницы при сравнении популяции Gy с популяциями из C и H. от G, T и Y, с C и H.

Таблица 2. Профили жирных кислот в 6 популяциях китайских митеновых крабов из разных озер.

Процент агрегированных MUFA был значительно выше ( P <0,05) у крабов из T, чем у крабов из G. Однако процент MUFA у крабов из T существенно не отличался от образцов, взятых из C, Gy и Y. Кроме того, не наблюдалось никаких различий при сравнении крабов из G с крабами из C, H и Y. Процент ПНЖК был значительно выше у крабов из C, G, H и Y, чем у крабов из Gy, однако существенных различий не наблюдалось. наблюдались при сравнении крабов из T с крабами из Gy и при сравнении крабов из C, G, H и Y.Совокупный процент НЖК (МНЖК и ПНЖК) оказался выше у крабов из G, Y и T, чем у крабов из Gy ( P <0,05), но не было различий между популяциями Gy, C и H. . Процент агрегированных НЖК также был сопоставим между популяциями C, G, Y и H.

Дендрограмма, показывающая взаимосвязь между составом FA краба и географическим положением

Профили FA шести популяций крабов значительно различались в зависимости от их географического происхождения.Это говорит о том, что эти профили FA могут зависеть от географического распределения этих крабов (рис. 1A). Чтобы проверить эту гипотезу, мы создали дендрограмму с использованием набора данных профиля FA (рис. 1B), которая разделила шесть популяций на две группы: Y, G и T, сгруппированные в первую оболочку, и H, Gy и C, сгруппированные в другую. одетый. Полученный в результате кластерный стиль соответствовал географическому распределению популяций крабов. Подобные закономерности были показаны с помощью анализа главных компонентов (PCA) (рис. 1C).На дендрограмме озера Y и T принадлежали к географической ветви A, а H и Gy принадлежали к географической ветви B. G и C принадлежали к географическим ветвям, которые соединяют ветви A и B (Рисунок 1B).

Чтение последовательности, сборки, сопоставления и определения характеристик

Общее количество необработанных считываний последовательностей для образцов содержимого кишечника и слизистой оболочки составило 4218454 необработанных считывания (в среднем 95 874 считывания на образец) и 3 947 857 общих чистых считываний (в среднем 89 724 считывания на образец) соответственно (дополнительная таблица S1) .Чистые чтения были депонированы в базу данных архива чтения последовательностей в NCBI (SRR12277956-SRR12277999).

Структура кишечного бактериального сообщества варьируется в зависимости от географического происхождения популяции крабов

Альфа- и бета-разнообразие

Параметры альфа-разнообразия (Шеннон, Симпсон, ACE и Chao1) были нормализованы и рассчитаны для всех популяций крабов с порогом идентичности 97% (дополнительная таблица S2). Построены параметры альфа-разнообразия (дополнительные рисунки S1A – D, S3B).Результаты показали, что крабы из Т имели наименьшее видовое богатство бактерий и альфа-разнообразие. Те из H имели самое высокое видовое богатство бактерий, в то время как из Y было самое высокое разнообразие. Кроме того, крабы из H имели наибольшее взвешенное и невзвешенное видовое разнообразие (дополнительные рисунки S1C, D). Крабы из G имели самое низкое взвешенное видовое разнообразие, а крабы из T имели самое низкое невзвешенное бета-разнообразие. Результаты кривых разрежения и рангового содержания показывают, что количество отобранных проб является разумным (дополнительный рисунок S2).

Кривые разреженности и рангового обилия — это общие кривые, которые описывают разнообразие образцов в группе. Кривая разрежения ясно показывает, насколько разумным является объем данных секвенирования, и косвенно отражает богатство видов образца. Если кривая пологая, это означает, что объем данных секвенирования является приемлемым, а больший объем данных приведет только к появлению небольшого числа новых видов (OTU). Для построения кривых разрежения и ранжирования численности из выборки случайным образом выбирали определенный объем данных секвенирования, и количество видов, представленных этими данными (т.е., количество OTU) было подсчитано.

Ранговая кривая численности показывает относительную численность видов (числа OTU), начиная от наиболее многочисленного до наименьшего. Чтобы получить соответствующий порядковый номер, найдите код сортировки OTU по оси абсцисс, а затем соответствующую относительную численность OTU (или количество видов для каждой последовательности) по оси ординат и соедините эти точки пунктирными линиями. Обычно ранговая кривая численности отражает богатство и равномерность видов в выборке.Видовое богатство отражено шириной кривой по оси абсцисс. Чем больше видовое богатство, тем шире площадь кривой по горизонтальной оси. В вертикальном направлении плавность кривой отражает равномерность видов в образце. Чем пологее кривая, тем однороднее распределение видов (Lundberg et al., 2013).

Наши кривые разрежения, как правило, были плоскими, что указывало на то, что количество секвенированных образцов было разумным и могло отражать реальную ситуацию с тестируемыми образцами (дополнительный рисунок S2A).Сравнивались индексы численности для 6 популяций, которые сначала снизились, а затем увеличились у крабов из H и Y, с самым высоким у крабов из H и самым низким у крабов из T (дополнительный рисунок S2B). Если посмотреть по оси абсцисс на ширину ранговой кривой численности, крабы из H имели самую широкую кривую и самое высокое видовое богатство, тогда как крабы из T имели самую узкую кривую и самое низкое видовое богатство, что соответствовало результатам кривая разбавления. Вертикальная ось показывает, что крабы из H имели самую гладкую кривую, тогда как крабы из Y имели самую крутую кривую.Таким образом, с точки зрения видовой однородности крабы из H показали наибольшую однородность, а крабы из Y — наименее однородные.

Структура ОТУ на разных уровнях классификации

Как описано в разделе «Профили FA как биомаркеры популяций крабов из разных географических мест», профили FA шести популяций крабов могут использоваться для определения географического происхождения. Различия, наблюдаемые между профилями ЖК разных популяций крабов, объясняются вариациями кишечных бактерий, на которые влияют различные условия окружающей среды, преобладающие в каждом географическом месте.Таким образом, в этом исследовании мы проанализировали тип и численность кишечных микробных сообществ, обнаруженных в шести популяциях крабов. Анализ показал, что в общей сложности 1066 различных видов бактерий были общими для шести популяций крабов, а у крабов из Т было наименьшее количество видов бактерий (87) (дополнительный рисунок S3A).

Было построено дерево классификации видов (по умолчанию на основе 10 лучших значений относительной численности на уровне родов) (Pond et al., 2006), а царство, тип, класс, порядок, семейство, род и виды были упорядочены из слева направо (дополнительный рисунок S4).Он показал структуру OTU всех шести популяций крабов на разных таксономических уровнях. На уровне филума наиболее доминирующими бактериями во всех популяциях крабов были Tenericutes. Однако существенных различий в долях Tenericutes среди этих популяций не было. Крабы из Gy имели самые высокие пропорции Bacteroidetes на всех уровнях ниже, включая тип (класс, семейство и род). Крабы из C имели наибольшее количество Firmicutes, за ними следовали крабы из Y, а затем из других популяций.Крабы из G имели наибольшее количество протеобактерий. На уровне рода распределение конкретных бактериальных популяций было сходным с распределением филума. Среди идентифицированных бактерий Shewanella был обнаружен только у крабов из G, Y и Gy на основе уровня 0,01 (дополнительный рисунок S4 и дополнительная таблица S3).

Для определения структуры доминирующих родов в каждой группе были отобраны 10 и 30 лучших родов на основе относительной численности для построения кумулятивной гистограммы (рис. 2).Доминирующими родами были Aeromonas , Bacteroides , Dysgonomonas , Candidatus Hepatoplasma и Candidatus Bacilloplasma (рис. 2А). Среди них Candidatus Bacilloplasma был наиболее распространенным и присутствовал у более чем 0,5% крабов T. На 10 ведущих родов приходилось 75% почти каждой популяции. Это распределение существенно не изменилось, когда в набор данных были добавлены еще 20 родов (рис. 2B). Чтобы отобразить филогенетическое родство видов бактерий, обнаруженных в популяциях крабов, для построения кладограммы LEfSe (дополнительный рисунок S5A) были использованы 100 лучших родов, полученных в результате множественного выравнивания последовательностей и анализа относительной численности.

Рис. 2. Гистограмма относительной численности кишечных бактерий на уровне рода. (A) Относительная численность 10 ведущих родов. (B) Относительная численность 30 ведущих родов.

Относительная численность каждого рода бактерий в каждой популяции крабов отражается их пропорциональным представлением на внешнем кольце (дополнительный рисунок S5A). Tenericutes были самыми многочисленными, Bacteroidetes — третьими по численности, а Proteobacteria были наименее многочисленными среди популяций крабов.Чтобы идентифицировать роды, которые были сгруппированы в определенные образцы, была создана тепловая карта (тепловая карта) из 35 лучших родов на основе их численности и таксономической аннотации (дополнительный рисунок S5B).

Эволюционное расстояние и взаимосвязь между бактериальными сообществами, обнаруженными в различных популяциях крабов

Генетические различия между бактериальными сообществами

Для расчета коэффициента несходства между двумя популяциями использовались взвешенные и невзвешенные расстояния Unifrac.Чем меньше значение, тем меньше разница в разнообразии между этими двумя популяциями. Была создана тепловая карта на основе взвешенных и невзвешенных расстояний Unifrac (рис. 3A). Для взвешенного расстояния Unifrac коэффициент несходства между группами Y и C составил 0,484, что было наименьшей разницей среди шести популяций, что указывает на то, что эта пара имела наибольшее сходство по видовому разнообразию. Самый большой коэффициент несходства (2,045) наблюдался между крабами из G и Gy, что указывает на то, что эти две популяции больше всего различались с точки зрения видового разнообразия.Для невзвешенного расстояния Unifrac коэффициент несходства для крабов из C и T составил 0,277, что было наименьшим значением, тогда как самый высокий коэффициент различия (0,680) был между крабами из Y и H.

Рис. 3. Тепловая карта бета-разнообразия и взаимосвязи между профилем жирных кислот и бактериальным сообществом. (A) Взвешенные и невзвешенные расстояния Unifrac. (B) Взаимосвязь между C22: 6 жирными кислотами и кишечным бактериальным сообществом. (C) Взаимосвязь 20: 3 жирных кислот и кишечного бактериального сообщества.

Биомакеры для разных популяций, исследованные LefSe

После определения коэффициентов различия среди шести популяций крабов, впоследствии были проанализированы конкретные бактерии и их эволюционные отношения (дополнительный рисунок S6A). Prolixibacteraceae , Lachnospiraceae и Erysipelotrichaceae были обнаружены только у крабов из Gy, тогда как неидентифицированные Bacteroidales были обнаружены только у крабов из Y.На уровне порядка Bacteroidiales и Clostridiales были обнаружены только в популяциях из C. На уровне филума Tenericutes и Proteobacteria наблюдались у крабов из T и G; Alphaproteobacteria были обнаружены только у крабов из H. Относительная численность каждого рода бактерий в шести популяциях показана на дополнительном рисунке S6B.

Структура бактериального сообщества в различных популяциях крабов и их специфические таксоны

Метод metaStat был использован для идентификации бактерий, которые значительно различались в шести популяциях крабов.Были представлены различия в численности видов бактерий, распределенных между популяциями, включая 12 типов бактерий, которые показали наиболее значимые различия, и те, которые не показали различия. Были нанесены все структуры бактериальных родов, которые показали значительную численность при попарном сравнении ( n = 5 на популяцию крабов) (рис. 4). С помощью теста metaStat было идентифицировано 35 родов из 3 пар популяций крабов (Gy-H, G-Y и G-T).

Рисунок 4. Тепловая карта корреляционной матрицы между популяцией крабов и сообществами бактерий. Красно-оранжевые тона указывают на положительную корреляцию между популяцией крабов и сообществами бактерий; синий и желтый белый цвет указывают на отсутствие корреляции, так как, например, pragia не имеет корреляции с крабами из Gy, что означает, что pragia не была обнаружена у крабов из Gy.

Эволюционный анализ структур бактериальных сообществ, обнаруженных в популяциях крабов, с использованием PCA

В настоящем исследовании мы провели анализ родов бактерий, обнаруженных в микробных сообществах шести популяций крабов (рис. 5А).PC1 разделил образцы на две группы: одна группа состояла из крабов из Y, C и Gy, а другая группа состояла из крабов из T, H и G. PC2 также разделила популяции крабов на две группы. Одна группа состояла из крабов из T и Y и небольшое количество крабов из Gy и C, в то время как крабы из H и G были разделены на другую группу. PC1 и PC2 в основном разделили шесть популяций крабов на две группы, что указывает на значительные различия в бактериальном составе между популяциями крабов.

Рисунок 5. Кластерный анализ всех групп на основе бактериального сообщества. (A) PCA график иллюстрирует различия в кишечных бактериальных сообществах различных популяций крабов. (B) Дерево кластеризации UPGMA на основе взвешенного расстояния Unifrac.

Для изучения сходства между популяциями крабов использовался метод невзвешенных парных групп со средним арифметическим (UPGMA). Этот кластерный анализ основан на невзвешенной матрице расстояний Unifrac (рис. 5B).Левая часть — это дерево кластеризации UPGMA, а правая часть — относительная численность бактериальных сообществ на уровне филума. Кроме того, возможно, что расстояние между группами C и T было наименьшим, и затем они были сгруппированы по Gy, Y, G и H. Среди этих популяций H и C были самыми дальними друг от друга.

Взаимосвязь между профилями FA и структурами бактериального сообщества

Чтобы определить взаимосвязь между профилями FA крабов и составом их кишечных микробных сообществ, мы сравнили две дендрограммы, которые отображают профили FA и структуры бактериального сообщества.Результаты показали, что положения озер крабового происхождения были одинаковыми на двух дендрограммах (профили FA и дендрограммы структур бактериального сообщества), за исключением H и Y, которые поменялись местами на этих дендрограммах (Рисунки 1B, 2B). Чтобы определить причину этого различия, была исследована взаимосвязь между FA и структурой бактериального сообщества. Был проведен каминный тест, сравнивающий каждую FA, которая показала значительную разницу между популяциями крабов, с набором данных OTU последовательности 16S (дополнительная таблица S4).Для определения взаимосвязи между профилями ЖК и структурой бактериального сообщества анализ проводился в два этапа. На первом этапе все профили FA для каждой популяции крабов коррелировали с набором данных бактериальных OTU, который показал, что FA в значительной степени связаны с бактериальным сообществом. На втором этапе все профили FA, которые значительно различались среди шести популяций крабов, были сопоставлены с набором данных бактериальных OTU. Это показало, что значительные различия в относительной численности специфических ЖК могут быть вызваны разными бактериальными сообществами.Анализ канонических соответствий (CCA) и дистанционный анализ избыточности (dbRDA) также использовались для дальнейшего понимания того, как состав FA связан с бактериальными сообществами (дополнительные таблицы S5, S6). Были идентифицированы все ЖК, которые значительно различались, а ЖК подокарповая кислота (C20: 3) и цервоновая кислота (C22: 6), которые варьировались в соответствии с изменениями структур бактериальных родов, были проанализированы с помощью корреляции Спирмена ( P <0,01). и они были нанесены на кладограммы (Рисунки 3B, C).Роды, которые коррелировали с изменениями подокарповой кислоты (C20: 3) и цервоновой кислоты (C22: 6), были Fusobacterium и Roseimarinus . Результаты корреляционного анализа Спирмена состава ЖК и структуры бактериального сообщества на уровне рода показаны в дополнительной таблице S7.

Обсуждение

Профили FA как биомаркеры географического положения популяций крабов

Наше исследование показало, что профили FA шести популяций крабов значительно различались и зависели от географического происхождения этих крабов (Таблица 2 и Рисунки 1A, B, 2).Аналогичным образом Sillero-Ríos et al. (2018) сообщили о значительных вариациях в составе ЖК Octopus vulgaris , населяющих три прибрежных района в западной части Средиземного моря. Значительные различия в составе ЖК 22: 6 n-3 (DHA, докозагексаеновая кислота) и 22: 5 n-3 (EPA, эйкозапентаеновая кислота) были обнаружены в мантии O. vulgaris , взятых из этих районов. Аналогичным образом Rude et al. (2016) продемонстрировали, что профили ЖК синежабрых значительно различаются в зависимости от среды обитания, что позволяет предположить, что профили ЖК могут использоваться в качестве биомаркеров среды обитания рыб.Другие исследования, проведенные на наземных животных, также показали, что состав ЖК молока, мышц и других тканей может быть связан с географическим происхождением этих животных (Rutkowska et al., 2015; Kumar et al., 2016; Barłowska et al. , 2018). Кроме того, в исследовании, посвященном микробиоте и липидам, было обнаружено, что состав липидов (в частности, ПНЖК) и микробиоты молока различается у животных, выращенных в разных географических регионах (Kumar et al., 2016). Одна из причин этого различия — окружающая среда.В исследовании, направленном на изучение влияния окружающей среды на козье молоко, было обнаружено, что разведение коз в определенных географических регионах увеличивает долю полезных ЖК в молоке и улучшает качества, ценимые потребителями (Barłowska et al., 2018). Кроме того, в коровьем молоке было обнаружено высокое содержание линолевой кислоты (CLA), вакценовой кислоты (VA), общего C18: 1-транс и гамма-линоленовой кислоты (GLA, C18: 39c12c15c n-6), альфа-линоленовой кислоты. кислоты (ALA, C18: 39c12c15c), были характерны для польских горных регионов, в то время как короткоцепочечные насыщенные ЖК (SCFA, C4: 0 – C11: 0) — для равнин (Rutkowska et al., 2015). Таким образом, наши результаты предполагают, что профили FA могут использоваться в качестве биомаркеров географического происхождения крабов.

На состав ЖК влияет структура бактериального сообщества в кишечнике краба

Многочисленные исследования показали, что структура кишечного микробного сообщества влияет на состав ЖК. Например, с использованием комплексного мультиомного подхода было показано, что микробиота кишечника индуцирует образование MUFA стеароил-CoA-десатуразой 1 и удлинение PUFA с помощью FA-элонгазы 5, что приводит к значительным изменениям профилей ацильных цепей глицерофосфолипидов (Kindt et al., 2018). Точно так же в настоящем исследовании наш анализ позволил сформировать паттерны, которые связывают профили ЖК с кишечными бактериальными сообществами (рисунки 1B, 2B и дополнительная таблица S4). Подобные вариации наблюдались как для составов ЖК, так и для кишечных бактериальных сообществ в зависимости от географического происхождения популяций крабов. Однако, в соответствии с другими ассоциативными исследованиями микробиоты кишечника, основная задача состоит в том, чтобы объяснить лежащие в основе биологические механизмы и установить причину наблюдаемых взаимосвязей.Кроме того, обычно отсутствует информация о взаимосвязи между кишечными бактериальными сообществами и профилями ЖК ракообразных. Тем не менее, исследования, проведенные на людях, грызунах (мышах), рыбках данио и других животных, предоставляют возможные биологические механизмы, которые могут объяснить взаимосвязь между бактериальным сообществом и составом ЖК, наблюдаемую в настоящем исследовании (Ley et al., 2006; Semova et al. , 2012; Чакраборти, 2015). Ley et al. (2005) сообщили о значительных различиях в пропорциях Firmicutes и Bacteroidetes у мышей.У тучных мышей относительные доли Firmicutes и Bacteroidetes значительно увеличились и уменьшились, соответственно, по сравнению с нормальными мышами. Точно так же у детей с ожирением соотношение Firmicutes к Bacteroidetes было выше, чем у худых детей (Bervoets et al., 2013). Увеличение численности Firmicutes часто связывают с увеличением запасов липидов из-за ожирения (Ley et al., 2005, 2006). Другие кишечные бактерии, связанные с метаболизмом ЖК, потреблением и хранением энергии, включают сахаролитические бактерии, лактобациллы и стафилококки (Ley et al., 2006; Пачикян и др., 2011; Чакраборти, 2015). Одно исследование показало, что при определенных условиях у людей и мышей некоторые виды сахаролитических бактерий участвуют в накоплении жира и метаболизме (Ley et al., 2008). Примерно видов Staphylococcus положительно связаны с потреблением энергии у детей (Bervoets et al., 2013). Более того, Million et al. (2012) сообщили, что видов Lactobacillus , благодаря своей роли в метаболизме ЖК, связаны с увеличением массы тела и ожирением у взрослых.Кроме того, многие исследования показали, что Firmicutes, по сравнению с другими типами бактерий, имеют сильную связь с абсорбцией, метаболизмом и хранением ЖК (Ley et al., 2006; Semova et al., 2012; Chakraborti, 2015). У рыбок данио увеличение численности Firmicutes коррелировало с увеличением количества липидных капель и стимулированием абсорбции ЖК (Semova et al., 2012). В настоящем исследовании наблюдались значительные различия в пропорциях Firmicutes и Bacteroidetes (дополнительный рисунок S4 и дополнительная таблица S3).Таким образом, различия в кишечных бактериальных сообществах, особенно в относительной численности Firmicutes и Bacteroidetes, могут быть ответственны за вариации в составе ЖК в различных популяциях крабов.

Кроме того, другие исследования пытались проверить и объяснить взаимосвязь между кишечными бактериальными сообществами и профилями ЖК. Например, Kindt et al. (2018) использовали краткосрочное лечение антибиотиками для воздействия на микробную экосистему кишечника животных (SPF), свободных от конкретных патогенов (мышей), и обнаружили, что относительные FA 16: 0, FA 20: 3, FA 20: 4 и FA 22 : Эта обработка повлияла на 6 уровней.Точно так же у японских перепелов-несушек ( Coturnix coturnix japonica ) состав ЖК липидов печени может быть изменен путем манипулирования микрофлорой кишечника (Furuse et al., 1992). В настоящем исследовании присутствие подокарповой (C20: 3) и цервоновой (C22: 6) кислот было исследовано с помощью анализа перекрытия CCA и dbRDA (рисунки 2, 3A и дополнительные таблицы S5, S6). Мы обнаружили, что изменения численности некоторых бактерий Fusobacterium и Roseimarinus коррелировали с изменениями в составе FA 20: 3 и FA 22: 6 у крабов.Аналогичным образом, в популяциях крабов Gy и C содержание FA 20: 3 было выше, чем в других популяциях, и это коррелировало с более высокой численностью Bacteroidetes и Firmicutes (Рисунки 4B, C). Бактерии были идентифицированы с помощью корреляционного анализа Спирмена для определения влияния состава ЖК (дополнительная таблица S6).

Структура кишечного бактериального сообщества связана с географическим положением

Как правило, структура бактериального сообщества в кишечном тракте рыб из разных озер различна, что может зависеть от многих факторов (таких как источник пищи, качество воды и образ жизни) в озере.Например, при исследовании цихлид, обитающих в двух кратерных озерах, состав кишечной микробиоты, в частности Oceanospirillales (52,28%; галотолерантные или галофильные бактерии), различался между двумя популяциями (Franchini et al., 2014). Однако как стадия развития, так и географическое положение являются важными детерминантами бактериального состава кишечника комаров (Bascuñán et al., 2018). Таким образом, как стадия развития животного, так и его географическое положение определяют бактериальный состав кишечника (Finkel et al., 2011). Изменения в составе микроорганизмов, связанных с организмом-хозяином, также были проверены на деревьях тех же видов, которые выращивались в различных климатических регионах. На деревьях находились различные микробные ризосферные и филлосферные сообщества (Finkel et al., 2011). Приведенные выше результаты согласуются с результатами нашего исследования. В настоящем исследовании мы обнаружили значительные различия в составе кишечных бактерий на уровне и более низких таксономических уровнях в зависимости от географического происхождения популяции крабов (рисунки 2, 3A, 5 и дополнительная таблица S6).Однако географическое положение не оказало значительного влияния на микробные сообщества кишечника выращиваемого морского леща ( Sparus aurata ) и морского окуня ( Dicentrarchus labrax ) (Bass et al., 2018).

Характеристики окружающей среды являются одними из факторов, определяющих состав бактериального сообщества. Исследование на мышах показало, что тип потребляемой воды значительно влияет на состав кишечной микробиоты (Dias et al., 2018). У рыб на структуру кишечного микробного сообщества может влиять вода и другие вещества, содержащиеся в воде.Добавление микроводорослей в резервуары для выращивания повлияло на состав и динамику микробных сообществ в воде для выращивания (Giménez Papiol et al., 2018). Было обнаружено, что общий органический углерод, н-алканы, нефтяные углеводороды и другие соединения тесно связаны с составом бактериального сообщества на разных глубинах воды и отложений, происходящих из различных регионов Восточного Средиземного моря (Polymenakou et al., 2005). . Выбор продуктов питания также играет важную роль в формировании состава и активности кишечной микробиоты (Zhao et al., 2018). Еще один фактор, который сыграл роль в географическом определении бактериального состава, — это экология. В исследовании Sullam et al. (2012) было обнаружено, что состав кишечных бактерий рыб определяется филогенией хозяина, соленостью воды и трофическим уровнем. В озерах наиболее важным источником бактерий является местное сообщество, однако распространение этих источников оказывает ограниченное непосредственное воздействие на кишечное бактериальное сообщество (Comte et al., 2017).

Кишечник рыбы находится в постоянном контакте с окружающей водой, однако было показано, что многие таксоны микробов, присутствующие в окружающих водах, не обнаруживаются в кишечнике рыб и наоборот.Это говорит о том, что факторы, связанные с хозяином, сильно влияют на состав сообщества кишечных бактерий по сравнению с факторами окружающей среды (Schmidt et al., 2015). В настоящее время оценивались только сообщества кишечных бактерий, параметры окружающей среды и микробные сообщества в окружающей воде не оценивались. Это главное ограничение нашего исследования, поэтому было трудно количественно определить и определить точные факторы, ответственные за наблюдаемые изменения в сообществах кишечных бактерий. Тем не менее, стандартные параметры воды для озер, где отбирались популяции крабов, можно найти в (GB3838-2002).

В то время как некоторые недавние исследования предполагают, что как факторы, связанные с хозяином, так и факторы окружающей среды, вносят значительный вклад в структуру микробного сообщества кишечника рыб (Dehler et al., 2017), другие предполагают более сильное влияние селективного давления хозяина (генетика хозяина) (Li et al. др., 2017). Следовательно, сборка кишечной микробиоты у рыб может в первую очередь контролироваться детерминированными процессами из-за ограничений, зависящих от хозяина (Yan et al., 2016). Особи одного и того же вида рыб, обитающие в разных средах обитания, часто являются хозяевами различного количества и типа кишечных микробных сообществ, которые, как правило, соответствуют вариациям в их генетической конституции (Dolan, 2005; Allan and Max, 2010; Neuman et al., 2016). Генетический фон популяций крабов, включенных в настоящее время, оценивался в другой нашей работе (Munganga et al., Неопубликовано), анализ не показал значительной генетической дифференциации среди шести популяций, не наблюдалось географической фоновой кластеризации популяций.

Точная степень, с которой каждый из этих факторов влияет на микробиом кишечника, неизвестна. Очевидно, что трудно различить влияние хозяина и окружающей среды на микробиоту кишечника рыб.Различия в пищевом поведении разных видов усугубляют проблему исследования роли каждого из этих факторов. В будущих исследованиях будет важно включать дополнительные факторы, такие как трофические уровни, потенциальное влияние параметров окружающей среды (например, состав рациона, динамика пищевой цепи, глубина и температура воды, географическое положение), и сравнивать вариации в зависимости от сезона.

Заключение

Подобно млекопитающим, микробные сообщества кишечника рыб играют неотъемлемую роль в пищеварении в кишечнике хозяина, метаболическом гомеостазе, физиологии, иммунном ответе и ответе на лечение болезни.Таким образом, понимание принципов, регулирующих сборку и поддержание кишечных микробов в кишечнике животных, а также их взаимодействие с хозяином и окружающей средой, стало основным направлением деятельности. В соответствии с результатами предыдущих исследований, текущее исследование представляет интересные результаты о взаимодействии между кишечным бактериальным сообществом, организмом-хозяином и окружающей средой. Профили FA шести популяций китайского краба-рукавицы значительно различались в зависимости от географического происхождения.Подобные изменения наблюдались также в составе кишечника, который варьировался в зависимости от географического происхождения. Дальнейший анализ профилей ЖК и микробного сообщества кишечника позволил сформировать паттерны, которые связывали эти два параметра. Было обнаружено, что профили FA в значительной степени связаны с составом бактериального сообщества крабов из каждой географической области. Следовательно, было обнаружено, что микробное сообщество кишечника, по-видимому, вносит значительный вклад в состав ЖК китайского миттенового краба.Это дает новые идеи, которые могут помочь в будущих исследованиях питания китайских крабов-рукавиц и других связанных областей. Кроме того, было показано, что вариации в составе ЖК являются потенциальным биомаркером географического фона крабов. Наше исследование представляет собой лишь ранний анализ взаимосвязи между составом ЖК и сообществом кишечных бактерий китайского миттенового краба, и необходимы дальнейшие исследования, чтобы обеспечить более глубокое понимание этих взаимодействий. Эти исследования помогут нам раскрыть сложность микробных взаимодействий между хозяином и кишечником для возможных применений в аквакультуре и сохранении видов.